目前疫情的防控工作取得了階段性的成效，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的核酸檢測技術(shù)在新冠病毒快速鑒定及確診中發(fā)揮了重要作用。

什么是實(shí)時(shí)熒光定量PCR?

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR,是在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)(熒光染料或熒光標記的特異性探針)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍。運用該項技術(shù)，可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、絕對定量和定性分析。

實(shí)驗流程：

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗中，可以分為樣本采集，RNA提取，RNA質(zhì)量鑒定，反轉錄及數據分析幾個(gè)步驟，在進(jìn)行引物、模板的稀釋?zhuān)噭┑呐渲坪脱a足反應體系時(shí)都會(huì )用到水，水質(zhì)量的好壞直接影響最終數據分析的結果。

水中的顆粒物，離子含量，有機物及細菌微生物等雜質(zhì)對實(shí)驗都會(huì )帶來(lái)影響，最值得關(guān)注的因素有以下兩個(gè)方面：

1. DNA酶和RNA酶

DNA酶和RNA酶能夠特異性地降解DNA和RNA。在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，去除這兩種酶從而保證提取的RNA和DNA樣本的完整性十分關(guān)鍵。尤其在提取RNA的時(shí)候，RNA極易被降解。這是因為RNase非常穩定，且無(wú)處不在，用常規的高溫高壓蒸汽方法和蛋白酶抑制劑不能使所有的RNase完全失活。如果樣本中的核酸被降解，會(huì )影響檢測結果的準確性，甚至造成假陰性檢測結果。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗用超純水必須有效降低DNA酶和RNA酶的含量，減少對實(shí)驗的影響。

2. 鎂離子

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗需要根據不同的引物對和模板確定最佳的鎂離子濃度。

Mg2+濃度過(guò)低，會(huì )影響DNA聚合酶的活性，導致產(chǎn)量降低，影響實(shí)時(shí)定量的敏感性;

Mg2+濃度過(guò)高，會(huì )增加引物二聚體的形成，這會(huì )影響特異性。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗用超純水必須控制Mg2+濃度，避免背景因素帶來(lái)的不確定性。

綜上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗推薦使用超純水，水質(zhì)要求如下圖所示：